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17 Settembre 2019

Il Flusso di lavoro integrato per una rapida selezione e ottimizzazione di linee cellulari di ibridoma

Gli ibridomi sono composti dalla fusione di cellule splenociti B rimossi dalla milza dell'animale immunizzato con l’antigene di interesse, e una linea cellulare tumorale di mielomia, così da produrre una linea cellulare ibrida immortalizzata, che può essere analizzata per determinare il legame con l’ antigene specifico.
Oggi, la maggior parte dei farmaci a base di anticorpi in commercio deriva da linee cellulari di ibridoma e gli ibridomi ibridi sono usati per produrre anticorpi monoclonali bispecifici. Lo screening di una fusione di ibridoma e la sottoclonazione dei candidatii ibridi, sono passaggi del processo di ricerca degli anticorpi monoclonalni che richiedono tempo.
La sfida non si presenta solo nello stabilire l’efficacia in vivo o nella mappatura degli epitopi nel processo di selezione dei candidati, ma anche nell’umanizzazione, nel miglioramento dell’affinità, negli studi esplorativi di sicurezza e nello sviluppo di biomaker durante il processo di ottimizzazione dei candidati. Inoltre, la quantifica e la valutazione della potenza degli anticorpi monoclonali (mAb) secreti assumono un ruolo fondamentale nella scelta del clone e del miglior candidato mAb per depositare la Biologics License Applications (BLA) presso la Federal Regulatory Agency (FDA). Grazie all’uso dei sistemi ForteBio Octet e ClonePix di Molecular Devices, flussi di lavoro integrati, dalla fusione alla selezione del clone, sono in grado di accelerare notevolmente lo screening degli ibridomi e portare ad una selezione più rapida dei migliori anticorpi ingegnerizzati o di altri candidati bioterapeutici. La flessibilità del sistema Octet nei saggi qualitativi può essere ulteriormente di aiuto per gli anticorpi bispecifici e multispecifici.

Figura 1: Workflow della generazione di un ibridoma e lo screening di una vasta libreria di anticorpi per individuare le molecole lead. Le tecnologie chiave coinvolte nel processo sono rappresentate in figura.

Uno dei principali limiti per la selezione dei cloni di ibridoma è la scarsa efficienza dell’immortalizzazione e della fusione. Per superare questo limite, la Molecular Devices ha sviluppato un terreno di coltura, l’XP Media, grazie a cui è possibile massimizzare la produttività e minimizzare i tempi pratici.
La limiting dilutiond è un metodo consolidato per lo screening degli ibridomi che producono anticorpi monoclonali. Al fine di garantire la monoclonalità per la Biologics License Applications (BLA), sono necessari due cicli di limiting dilution secondo l’analisi statistica della Distribuzione di Poisson. Questo metodo è pertanto laborioso, costoso e richiede molto tempo. Il ClonePix™ Mammalian Colony Picker è un sistema completamente automatizzato per la selezione di cloni validi per la ricerca su anticorpi. Fornisce un metodo efficace per individuare e selezionare i cloni specifici dell’antigene verso l’antigene d’interesse in un processo one-step. La tecnologia consente di selezionare monitorare automaticamente l'intera fusione in situ e isolare solo i cloni specifici verso l’antigene con l'isotipo di immunoglobulina desiderato. Se la fusione presenta numerosi cloni positivi all’antigene, Il ClonePix seleziona e raccoglie solo quelli con maggiore secrezione. La natura delicata della tecnologia garantisce un’elevata vitalità dei cloni selezionati (compresa tra il 90 e il100%). Eliminando i metodi tradizionali e riducendo i tempi in cui è richiesta la presenza di un operatore, il sistema ClonePix 2 non solo rende il processo più rapido, ma consente anche di interrogare contemporaneamente antigeni multipli.

La validità delle molecole selezionate può essere ulteriormente migliorata integrando la piattaforma Octet nel flusso di lavoro. Il sistema Octet viene utilizzato per analizzare i cloni secondo la costante di dissociazione, scegliendo quelli che presentono una maggiore affinità con gli anticorpi. Lo strumento consente lo screening ad alto throughput di surnatanti grezzi di ibridomi sia per il livello di espressione di anticorpi monoclonali sia per l’affinità con l’antigene target. Il sistema non contiene microfluidica, rendendolo robusto ed adatto all’analisi di matrici grezze. Le costanti di dissociazione vengono stimate direttamente sui campioni di surnatanti, consentendo di classificare i cloni in base alla potenza degli anticorpi prodotti, individuandone il più promettente già negli primi stadi del processo.

Quando l’integrazione del sistema Octet con con il nuovo kit ForteBio Sialic Acid (GlyS) (utilizzato per lo screening dell'acido sialico di in campioni grezzi e purificati) e con altri kit come il Residual Protein A (RPA) e Anti-CHO Host Cell Protein (HCP) permette di osservare attributi critici della qualità (critical quality attributes - CQAs) già nelle prime fasi del processo di selezione dei migliori candidati, riducendo al minimo i tempi di ottimizzazione. Molte aziende nel settore delle biotecnologie sfruttano il sistema Octet per screening automatici dei coloni positivi per affinità, ottenuti da un primo screening mediante test ELISA.

Figura 2: workflow utilizzato per lo screening di 2000 ibridoma grazie all’ Octet RED384, in meno di 24 ore. La produttività del sistema può essere migliorata grazie all’automatizzazione garantita dal team Advance Workflow Engineering Solution (AWES) dalla Molecolar Devices.

References
High-Throughput Hybridoma Generation and Selection for Antibody Discovery (www.moleculardevices.com/sites/default/files/en/assets/scientific-posters/reagents/ hybridoma-generation-and-selection-for-antibody-discovery.pdf)
Application Note 1: Use of the Octet QK System to Enhance Service in a Core Hybridoma Laboratory (www.fortebio.com/documents/ForteBio_App_Note_1.pdf)

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