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08 Aprile 2020

Misura della citotossicità con il Livecyte

La citotossicità è una misura della capacità di composti o sostanze di provocare la morte cellulare. Il saggio di citotossicità è ampiamente utilizzato nell'industria farmaceutica ed è uno strumento fondamentale nel processo di scoperta dei farmaci.
Questa nota applicativa descrive la capacità del sistema Livecyte™ di rilevare la morte cellulare in modo non invasivo. Un netto vantaggio nell'uso del sistema Livecyte™ è la capacità di ottenere, per un lungo periodo di tempo, immagini sia ad alto contrasto che quantitative, senza la necessità di introdurre marcatori fluorescenti nella cultura. I dati morfologici e quantitativi ottenibili permettono anche di determinare la modalità di morte cellulare. Inoltre, a causa della bassa potenza di illuminazione richiesta, le cellule rimangono vitali dopo l'imaging, consentendo ulteriori analisi a valle.

Materiali e Metodi

Colture cellulari

Le cellule A549 sono state seminate in piastre da 6 pozzetti con fondo di vetro ad una densità di 105 cellule per pozzetto. Il sistema Livecyte è stato utilizzato per acquisire immagini pticografiche in time-lapse, ogni 6 minuti per un periodo di 70 ore. Le immagini sono state ottenute usando un obiettivo 10x (NA 0.2). L'ambiente di incubazione è stato mantenuto a 37°C costanti e 5% di CO2 costante in aria. La morte cellulare è stata indotta con la somministrazione di staurosporina a diverse concentrazioni. Dopo l'acquisizione, le immagini sono state analizzate utilizzando il software Phasefocus Cell Analysis Toolbox (CAT) che restituisce le metriche di popolazione relative alla proliferazione e morte cellulare. Inoltre, sono state studiate le singole metriche cellulari come i dati morfologici e temporali.

Mortalità e proliferazione

L'output quantitativo di massa secca cellulare fornito dal sistema Livecyte consente di determinare la differenza tra morte cellulare e crescita cellulare. Le singole cellule sono state segmentate e monitorate mentre attraversavano la crescita e la mitosi cellulare o la morte cellulare (Figura 1). Durante la crescita cellulare, la massa secca della cellula aumenta fino a raggiungere la mitosi, dopodiché si divide in due cellule figlie che ricominciano a crescere (Figura 1a). Al contrario, durante la morte cellulare la massa secca non aumenta, anzi la cellula inizia a perdere massa una volta che la membrana è compromessa (Figura 1b).

Figura 1: Identificazione della crescita cellulare e della morte in label-free. a) Immagini rappresentative della cellula A549 tracciata (cellula 1) nella divisione mitotica in due cellule figlie (cellula 15 e 17) e andamento della misura quantitativa di massa secca; b) una cellula A549 che subisce la morte cellulare in seguito a trattamento con staurosporina 10 μM e relativa perdita di massa secca nel tempo.

Il calcolo della massa secca totale di tutte le cellule in un campo visivo può essere utilizzato per misurare sia la morte cellulare che la crescita cellulare della popolazione di cellule. La morte cellulare delle cellule A549 è stata indotta dalla somministrazione di concentrazioni crescenti di staurosporina (Figura 2). L'effetto della staurosporina è chiaramente evidente nella Figura 2a, che mostra immagini rappresentative a 0, 36 e 72 ore di cellule trattate con staurosporina 10µM e il relativo controllo. Al fine di quantificare il tasso di morte o proliferazione cellulare, la massa secca relativa (normalizzata alla massa secca totale al tempo 0) della popolazione è stata calcolata per ciascun punto temporale (Figura 2b). Il trattamento delle cellule con staurosporina 10µM ha comportato una riduzione della massa secca relativa (0, 65 e 72 ore), mentre nelle cellule non trattate si osserva un aumento quando le cellule crescono e proliferano (4,23 a 72 ore). Nello stesso test, misurando la massa secca totale nel tempo, si osserva anche l'effetto citostatico di 1µM di staurosporina e l'effetto antiproliferativo di 100, 10 e 1nM (Figura 2b).
Oltre ai dati basati sulla popolazione, il sistema Livecyte offre il vantaggio dell'analisi a singola cellula. Eseguendo questo tipo di analisi, sono disponibili informazioni morfologiche per studiare ulteriormente le modalità di azione della staurosporina (Figura 2c). Le cellule A549 trattate con staurosporina 10µM mostrano un aumento della sfericità cellulare, che è coerente con i cambiamenti morfologici durante la morte cellulare. L'applicazione di 1µM di staurosporina, tuttavia, ha mostrato un aumento della massa secca totale quasi trascurabile nelle prime 72 ore, indicando una risposta citostatica, insieme a una riduzione della sfericità cellulare, indicando un cambiamento nel fenotipo cellulare.

Figura 2: Effetto della staurosporina su una popolazione di cellule. a) fotogrammi ripresi ad intervalli di 0, 36 e 72 ore di una popolazione trattata con staurosporina e relativo controllo non trattato. b) metriche di massa secca relativa di popolazione calcolata per 72 ore a varie concentrazioni di staurosporina. c) metriche di sfericità cellulare media di popolazione calcolata per 72 ore a varie concentrazioni di staurosporina.

Conclusione

Questa nota applicativa dimostra l'utilizzo efficace del sistema Livecyte di Phasefocus per l'imaging e la quantificazione della tossicità cellulare in modo non invasivo. Ciò presenta vantaggi chiave, in quanto non richiede l'uso di marcatori fluorescenti né induce alcun effetto fototossico sulle cellule in fase di misurazione. Di conseguenza, il comportamento della coltura cellulare nel corso del tempo non è influenzato da eventuali effetti involontari indotti dal processo di imaging o dalla procedura di preparazione delle cellule.
L'ampio campo visivo, senza stitching e quindi senza alcun compromesso per l'elevata qualità dell'immagine raggiunta dal sistema Livecyte, offre la capacità di produrre sia analisi statisticamente significative della popolazione sia la capacità di interrogare il comportamento a livello della singola cellula. Ciò fornisce un ventaglio di informazioni molto più ampio sul comportamento della coltura cellulare in risposta all'introduzione di un particolare farmaco o a determinati stimoli.

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