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20 Luglio 2020

Misura della fototossicità della sonda SiR-DNA con il sistema Livecyte

Introduzione

La microscopia live in time-lapse è una tecnica consolidata e potente per lo studio della biologia delle cellule di mammifero in vitro. Che lo scopo sia investigare gli effetti di un trattamento farmacologico su una coltura cellulare oppure studiare il differenziamento cellulare da staminali pluripotenti a cellule differenziate, sta diventando sempre più impellente la necessità di ottenere grandi quantità di dati e di informazioni per poter avere un quadro sempre più completo dei fenomeni biologici, e di come questi si modifichino a seguito di determinati stimoli. Spesso le analisi di popolazione danno il vantaggio di avere una significatività statistica, ma al contempo risulta difficile uno studio dettagliato ed approfondito. Le applicazioni più comuni in time-lapse possono utilizzare approcci senza marcatura, ma spesso questo significa ottenere risultati a livello di popolazione e rinunciare al dettaglio dell’analisi a singola cellula. In alternativa, la maggior parte degli studi che possono fornire questo dettaglio di informazione ricorrono alla fluorescenza. L’utilizzo della fluorescenza ha dei notevoli vantaggi, permette di individuare molecole specifiche nelle cellule, caratterizzando sottopopolazioni diverse per esempio, e molto spesso è l’unico strumento che garantisce un’analisi a singola cellula. Sfortunatamente, le applicazioni in fluorescenza richiedono l'introduzione di coloranti o marcatori.

La marcatura ha il potenziale di alterare la normale funzione cellulare e indurre tossicità [1,2], mentre la fototossicità, ovvero la tossicità indotta dalla radiazione luminosa in sé, presenta una barriera aggiuntiva all'imaging di lunga durata, poiché anche la luce ad alta intensità richiesta per eccitare i fluorofori può alterare il comportamento cellulare e indurne la morte [3].

Le specie reattive dell'ossigeno sono la causa predominante della fototossicità [3] e la morte cellulare ne è il più evidente risultato [4], tuttavia possono esserci sottili cambiamenti indotti dalla fototossicità nella morfologia, motilità e proliferazione cellulare che rendono imprevedibili i risultati sperimentali [5]. Molto spesso si sottovaluta l’interferenza di questi effetti sulle conclusioni sperimentali, rischiando di confondere gli effetti della fototossicità come risultati dell’esperimento stesso, soprattutto se non si dispone di adeguati controlli.

Il Livecyte di Phasefocus utilizza la pticografia per generare immagini ad alto contrasto, paragonabile alla fluorescenza, usando basse potenze di illuminazione (4-7μW/mm2). La pticografia è una forma di Quantitative Phase Imaging (QPI), un filone emergente di tecniche di imaging che misurano il ritardo di fase della luce nel passaggio attraverso il campione. Nelle immagini generate con la pticografia le cellule appaiono come oggetti luminosi su uno sfondo scuro. Il contrasto migliorato, in combinazione con i dati derivanti dalla misura della fase, aumenta la robustezza degli algoritmi di segmentazione e tracking di ogni singola cellula, senza la necessità di marcatori o sonde fluorescenti [5]. Non solo questa tecnica permette di ottenere un’analisi a singola cellula senza necessità di marcatura, ma dà così la possibilità di misurare la fototossicità.

Questo studio mira ad indagare gli effetti della marcatura a fluorescenza e l'irradiazione dei LED sul comportamento delle cellule durante un esperimento di microscopia in time-lapse a lungo termine usando il sistema Livecyte. A questo scopo verranno valutati gli effetti morfologici e sulla proliferazione della marcatura con una sonda fluorescente eccitabile nell’infrarosso, nota per la sua ridotta tossicità rispetto ai classici intercalanti del DNA eccitabili nell’ultravioletto, il SiR-Hoechst o SiR-DNA.

Materiali e metodi
Colture cellulari

Le cellule MDA-MB-231 sono state regolarmente mantenute in DMEM + 10% terreno di coltura FBS (DCM) a 37 ° C con 5% CO2 / 95% di umidità prima degli esperimenti. Le cellule sono state raccolte utilizzando tecniche standard, il conteggio e la vitalità cellulare sono stati determinati mediante il saggio Tripan Blu (ViCell; Beckman Coulter®). Sono state seminate 1600 cellule/pozzetto in 30 pozzetti di una piastra da 96 e messe in coltura overnight. Il terreno di coltura è stato sostituito con DCM o DCM contenente 250 nM SiR-DNA (15 pozzetti per condizione) e le cellule sono state incubate per 30 minuti prima dell'imaging.

Imaging in time-lapse

Le immagini ad alto contrasto in label-free sono state automaticamente correlate, spazialmente e temporalmente, alle immagini in fluorescenza usando il Livecyte Kinetic Cytometer. Le cellule sono state monitorate acquisendo una regione (FOV) di 1 mm x 1 mm per pozzetto ad intervalli di 20 minuti per 120 ore, utilizzando un obiettivo Olympus PLN 10X (0,25NA). Le cellule sono state mantenute all'interno una camera ambientale a 37°C con 5% di CO2 e 95% di umidità. Per determinare gli effetti dell'irradiazione sul comportamento delle cellule, le cellule sono state esposte a irradiazione LED a 650 nm, in triplicato, a potenze crescenti di 0, 80, 200, 300 e 400 μW/mm2 per 500 ms.

Analisi

L'analisi delle immagini e la segmentazione automatizzata delle singole cellule sono state condotte dal software Livecyte Analyse. Le metriche di ogni singola cellula sono state prodotte utilizzando le dashboard di proliferazione e morfologia del software. Gli output sono stati formattati per questa nota applicativa utilizzando GraphPad Prism 8 (software GraphPad).

Risultati

Gli effetti dell'irradiazione dei LED sul comportamento delle cellule MDA-MB-231 con e senza l'inclusione del marcatore SiR-DNA sono stati valutati utilizzando il Livecyte Kinetic Cytometer.
In Figura 1 sono riportate delle immagini illustrative prese a 0, 60 e 119 ore di cellule marcate con SiR-DNA (a sinistra) e in label-free (a destra), irradiate a 650 nm con potenze di irradiazione crescenti.

Figura 1: Immagini in pticografia QPI e in fluorescenza correlativa di cellule MDA-MB-231 marcate con SiR-DNA (a sinistra) e in label-free (a destra), a 0, 60 e 119 ore. Potenza di irraggiamento 0-400 µW/mm2 per 500 ms, barra della scala 200 μm.

Proliferazione cellulare

La sola irradiazione non ha influenzato la proliferazione cellulare, il conteggio cellulare osservato a tutte le dosi di potenza di irradiazione, per ogni punto temporale fino a 120 ore (Figura 2) non mostra differenze significative. Al contrario, l'inclusione del SiR-DNA ha ridotto la proliferazione cellulare in modo significativo e proporzionale alla dose di irradiazione ricevuta, rispetto alle condizioni non irradiate e in label-free. La riduzione nella proliferazione è osservabile già dopo le prime 24 ore e va accentuandosi nel tempo (Figura 2).

Figura 2: Conteggio relativo delle cellule nel tempo in label-free (in alto) e marcate con SiR- DNA a varie potenze di irradiazione (in basso).

Figura 3: massa secca relativa nel tempo di cellule in label-free (in alto) e marcate con SiR-DNA (in basso) a vari livelli di potenza di irradiazione.

Massa secca totale

La massa secca cellulare è una metrica unica delle QPI e rappresenta la massa totale di tutti i componenti cellulari, tra cui proteine, lipidi, carboidrati e DNA, ad esclusione dell'acqua [6,7]. La massa secca totale per regione acquisita (FOV) viene calcolata automaticamente dal Livecyte fornendo una lettura diretta della massa cellulare totale in ciascuna immagine. Questo, in combinazione con la segmentazione di ogni singola cellula, risulta nel calcolo della massa secca di ogni cellula in ogni immagine. La massa secca totale combina gli effetti della crescita delle singole cellule tra le varie divisioni cellulari con la proliferazione dell’intera popolazione.
La massa secca relativa per campo visivo non è perturbata dalla sola dose di irradiazione, con aumenti di massa osservati nel tempo, a tutte le esposizioni di potenza, che mostrano valori comparabili (Figura 3). Tuttavia, la combinazione di SiR-DNA con l'irradiazione ha dimostrato di provocare un'inibizione dell'accumulo di massa secca in modo dose-dipendente dalla potenza di irraggiamento, diversamente dai controlli (Figura 3). Ciò indica che l'interazione tra il marcatore SiR-DNA e l'irradiazione a LED provoca dei cambiamenti osservabili e significativi nella crescita cellulare e nei tassi di proliferazione.

Area singola cellula e massa secca

Le immagini in label-free ad alto contrasto generate dal Livecyte consentono una solida segmentazione delle singole cellule durante esperimenti in time-lapse a lungo termine. La combinazione di segmentazione cellulare con le informazioni QPI fornisce un ventaglio di metriche morfologiche che include area cellulare, perimetro, spessore, massa secca e sfericità.

Figura 4. Area cellulare mediana nel tempo di cellule in label-free (in alto) e marcate con SiR-DNA (in basso) a vari livelli di potenza di irradiazione.

Figura 5: Grafico della massa secca cellulare media in colture cellulari senza marcatura (in alto) e con marcatura con SiR-DNA (in basso), a diverse potenze di irradiazione.

L'area cellulare mediana delle cellule marcate con SiR-DNA e irradiate è aumentata nel tempo in modo dose-dipendente alla potenza di irradiazione (Figura 4). In campioni marcati e irradiati l’aumento dell'area cellulare è anche correlato con un aumento della massa secca media per cellula (Figura 5), ​​suggerendo un accumulo dei componenti cellulari in risposta all’interazione tra sonda fluorescente ed eccitazione LED. Non è stato osservato alcun cambiamento significativo nell'area cellulare media o nella massa secca cellulare media nelle cellule di controllo.

Sommario

La fototossicità e i potenziali effetti delle sonde fluorescenti eccitabili nel blu e nel verde sono già stati riportati in letteratura [3, 4]. Un recente studio ha dimostrato che le sonde di DNA nel lontano infrarosso possono indurre danni al DNA e inibire la progressione del ciclo cellulare [7], tuttavia, gli effetti a lungo termine di queste sonde sono relativamente inesplorati.
In questo studio dimostriamo che le cellule MDA-MB-231 marcate con la sonda SiR-DNA, eccitabile nel lontano infrarosso, ed esposte a livelli standard di illuminazione mostrano comportamenti fenotipici diversi rispetto alle cellule non marcate, già osservabili dopo 24 ore. Le cellule marcate presentano una proliferazione e una crescita ridotte, nonché una maggiore area cellulare individuale e massa secca rispetto ai controlli senza marcatura.
I risultati evidenziano come gli effetti causati da sonde fluorescenti possono essere monitorati con il Livecyte per identificare il loro impatto sui saggi cellulari live. Concludiamo anche che in tutti gli esperimenti su cellule vive è necessario prestare molta attenzione nell’utilizzo di marcatori fluorescenti, anche se tali sonde sono percepite come non tossiche o a bassa tossicità.

 

Bibliografia
1.lford R, Simpson HM, Duberman J, Hill GC, Ogawa M, Regino C, Kobayashi H, Choyke PL (2009). Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: literature review. Mol Imaging 8(6):341-54.
2.Coutu DL, Schroeder T (2013). Probing cellular processes by long-term live imaging-historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126(Pt 17):3805-15.
3.Magidson V, Khodjakov A (2013). Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114:545-60.
4.Douthwright S, Sluder G 2017. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol 232(9):2461-2468.
5.Kasprowicz R, Suman R, O'Toole P 2017. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. Int J Biochem Cell Biol 84:89-95.
6.Barer R 1952. Interference microscopy and mass determination. Nature 169(4296):366-7.
7.Sen, Onur, Adrian T. Saurin, and Jonathan MG Higgins (2018). The live cell DNA stain SiR-Hoechst induces DNA damage responses and impairs cell cycle progression. Sci Rep 8(1):7898.

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