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06 Giugno 2018

Alfatest

Proteine PEGilate: migliorare la caratterizzazione dei coniugati con la SEC Triple Detection

Negli ultimi anni sono cresciuti esponenzialmente i biofarmaci, ovvero l’uso di biomolecole come farmaci, introducendo di conseguenza la necessità di una caratterizzazione più approfondita di queste molecole. Una delle possibili modifiche delle proteine terapeutiche è l’associazione con molecole di Glicole polietilenico (PEG): è la così detta PEGilazione che consente di aumentare la stabilità e quindi l’efficacia diminuendo la frequenza di somministrazione. La tecnica Size Exclusion Chromatography (SEC), conosciuta anche come Gel Permeation Chromatography (GPC), viene utilizzata per caratterizzare le proteine in soluzione, per studiarne il peso molecolare.

Qui illustriamo l’analisi di una proteina, l'Interferon α-5, coniugata con due diverse molecole di Glicole polietilenico (PEG). La proteina e le molecole di PEG sono state caratterizzate singolarmente, e in seguito i coniugati PEGilati utilizzando il detector SEC. I campioni sono separati con il sistema Viscotek TDAmax della Malvern Panalytical, associato a vari detector di refractive index (RI), ultraviolet (UV), light scattering (LS, SEC-MALS) e intrinsic viscosity (IV). I cromatogrammi vengono analizzati utilizzando il software OmniSEC. L’analisi dei segnali RI e UV dei coniugati consente di distinguere il contributo dei due componenti (proteine e PEG). Il segnale complessivo proveniente da ciascuno dei due detector viene determinato dalla seguente equazione:

Risultati e discussione
Il primo campione analizzato, l'interferone proteico α-5 viene eluito dopo circa 10,5 ml in un singolo picco con un peso molecolare misurato di 21 kDA. Come previsto, l'analisi del coniugato ha mostrato che il campione è al 99% costituito da proteine.
È stata anche misurata la viscosità intrinseca pari a di 0,0334 dL / g e il suo raggio idrodinamico (Rh) 2,2 nm.

In seguito, è stato analizzato il primo campione di PEG, PEG-1 (Figura 2), con un picco principale a circa 8,5 ml e un picco secondario eluato a 8 ml. Il picco principale dimostra un peso molecolare di circa 28 kDa, un valore di viscosità intrinseca di 0,364 dL/g e un raggio idrodinamico Rh = 5,5 nm, valori tipici per questa molecola. Come previsto, l'analisi del coniugato mostra che questo campione è composto da 1% di proteine, quindi corrisponde a PEG puro.
Come dimostrato dal relativamente elevato segnale di light scattering, il picco secondario corrisponde ad una piccola quantità di materiale aggregato.


Di seguito è stato analizzato il coniugato. Questo campione eluisce con un picco principale a circa 8,2 ml con una piccola spalla secondaria. Il picco principale presenta un peso molecolare di 46 kDa di cui il 48% è di natura proteica. Un semplice calcolo dimostra che il coniugato è quindi composto da circa 22 kDa di proteine e 24kDa di PEG. Questo calcolo indica chiaramente che questo coniugato è composto da 1 proteina coniugata con 1 molecola di PEG.
Per questa molecola, la viscosità intrinseca misurata è di 0,278 dL/g. Mentre il peso molecolare del coniugato è la somma delle due molecole, la viscosità intrinseca corrisponde ad un valore medio, tra la proteina e il PEG. Il Rh del coniugato è stato misurato a 6 nm. Come nel cromatogramma PEG, si osserva un piccolo picco secondario corrispondente a un aggregato di PEG di peso molecolare più elevato.

Nella seguente tabella sono riassunti i risultati ottenuti sia per le molecole separate che per il coniugato.

Per i risultati completi del secondo esperimento, scarica la nota applicativa