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17 Marzo 2020

Andrea Pigozzo

Parte 1 - Ricerca e sviluppo di anticorpi monoclonali: la tecnica BLI, un tool indipensabile

Questo approfondimento in 2 parti illustra come la tecnica BLI per l'analisi degli anticorpi, grazie alla sua versatilità e ampia scelta di chimiche superficiali, consente la messa a punto di esperimenti di caratterizzazione complessi e altamente informativi. Questa prima parte è dedicata alla caratterizzazione funzionale degli anticorpi monoclonali, la seconda parte si concentrerà sull’uso della tecnica BLI a supporto dei processi di produzione degli anticorpi.

Parte 1 - Gli Anticorpi monoclonali

Un anticorpo è una proteina prodotta dal sistema immunitario che è in grado di legarsi con un'elevata specificità a un antigene. Questi antigeni sono tipicamente altre proteine, ma possono essere carboidrati, piccole molecole o persino nucleotidi. Gli anticorpi sono potenti strumenti biochimici perché si legano specificamente ad un antigene, consentendo in tal modo il rilevamento e la quantifica di una proteina specifica trovando largo impiego in applicazioni diagnostiche e biotecnologiche. La loro alta specificità li rende inoltre estremamente versatili ed efficaci in applicazioni terapeutiche come i trattamenti contro il cancro.
Gli anticorpi sono proteine con una struttura a forma di “Y” costituiti da una regione costante che ne definisce l’isotipo, e una regione variabile che è unica e specifica per un particolare epitopo (Fig. 1).

Figura 1: Rappresentazione schematica di un anticorpo

Quando un anticorpo si lega a una proteina non sta interagendo con l’intera catena amminoacidica ma piuttosto con uno specifico segmento conosciuto come epitopo. Per epitopo si intende quindi lo specifico bersaglio dell’anticorpo. In generale, un epitopo ha una lunghezza di circa cinque o sei amminoacidi; di conseguenza, per ogni sequenza proteica, è tipicamente possibile trovare più anticorpi unici in grado di riconoscerla. Ciascuno di questi anticorpi si legherà infatti ad un epitopo specifico situato su quella proteina.
Il legame tra l'anticorpo e l'epitopo si verifica nel sito legante l'antigene, che è chiamato paratopo e si trova sulla punta della regione variabile dell'anticorpo. Ad ogni paratopo corrisponde quindi un unico epitopo.
Nel contesto dello sviluppo di un anticorpo personalizzato è quindi importante distinguere tra il targeting di un epitopo specifico o il “semplice” riconoscimento di una particolare proteina. Si distinguono quindi anticorpi policlonali e anticorpi monoclonali.
Un anticorpo policlonale rappresenta una raccolta di anticorpi che riconoscono più epitopi sullo stesso antigene. In altre parole, ciascuno di questi singoli anticorpi riconosce un epitopo unico che si trova su quell'antigene.
Al contrario, gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono una specifica categoria di anticorpi identici fra loro in grado di riconoscere in maniera altamente specifica un unico epitopo per antigene. Tecnicamente, ogni singolo anticorpo in una miscela policlonale è tecnicamente un anticorpo monoclonale; tuttavia, questo termine si riferisce generalmente al processo di produzione. Idealmente, dato un qualsiasi antigene, è possibile creare uno o più anticorpi monoclonali in grado di legarlo specificatamente rendendo possibile individuare, neutralizzare o purificare la sostanza in oggetto. Questa importante caratteristica degli anticorpi monoclonali li rende uno strumento estremamente efficace in biochimica, biologia molecolare, diagnostica e medicina.
Più “complicati” e costosi da produrre rispetto agli anticorpi policlonali presentano però numerosi vantaggi applicativi che li rendono ideali soprattutto in ambito terapeutico. Tra questi l'alta specificità per un singolo epitopo, una minore reattività incrociata, bassa tendenza a produrre reazioni di ipersensibilità, elevata produzione in laboratorio con elevata omogeneità e bassa variabilità tra i lotti e la tendenza a produrre migliori risultati nei test di quantifica proteica.

Soluzioni analitiche

Nell’ambito dello studio degli anticorpi la tecnica BLI – Bio Layer Interferometry grazie all’ampia scelta di chimiche superficiali consente la messa a punto di esperimenti di caratterizzazione complessi e versatili.
Oltre alla quantifica, diretta o indiretta, eseguibile anche in matrici complesse come lisati cellulari o altri fluidi biologici con un notevole risparmio di tempo (Fig. 2), è possibile eseguire esperimenti di caratterizzazione articolati e specifici.

Figura 2: Confronto tra i disegni sperimentali richiesti per la quantifica di anticorpi mediante piattaforma OCTET, analisi cromatografica HPLC e test ELISA

Tra questi, ad esempio, lo studio delle interazioni con i recettori Fc-gamma (FcγR). I recettori FcγR sono glicoproteine di membrana con affinità per la regione Fc di immunoglobuline G (IgG). FcγRs espressi sulla superficie delle cellule immuno-effettore svolgono un ruolo chiave nell'iniziare funzioni come la citotossicità cellula-dipendente mediata da anticorpi (ADCC), che rappresenta uno dei meccanismi principali di azione degli anticorpi monoclonali terapeutici. La capacità degli anticorpi monoclonali terapeutici di legare le FcγR può avere un forte impatto sulla loro sicurezza ed efficacia. L'induzione dell'ADCC da parte di un anticorpo dipende dalla sua affinità di legame sia con il bersaglio che con il FcγR. Pertanto gli sforzi per analizzare e migliorare le interazioni Fc con FcγRs sono diventati parte integrante dei processi di sviluppo bioterapeutici. Le figure 3 e 4 riportano alcuni esempi di disegni sperimentali implementabili grazie ai sistemi OCTET rendendo questo tipo di studi semplici ed alto contenuto informativo.

 

Figura 3: Esempio di disegno sperimentale utilizzando sensori Ni-NTA e recettore Fc-gamma  his-tagged

Figura 4: Esempio di disegno sperimentale utilizzando sensore specifici anti-Fab

L’epitope binning è un'altra tipologia sperimentale facilmente implementabile sulle piattaforme OCTET e consiste nella segmentazione di un pannello di anticorpi monoclonali (mAbs) in base alla regione dell'antigene, o epitopo, legato da ciascun anticorpo. Questo raggruppamento viene eseguito utilizzando saggi di competizione incrociata, in cui è caratterizzato il legame competitivo delle coppie di anticorpi ad un antigene specifico. Se il legame dell'antigene di un mAb impedisce il legame di un altro, allora questi mAbs sono considerati legarsi a epitopi simili o sovrapposti. Viceversa, se il legame di un mAb con l'antigene non interferisce con il legame di un altro, allora si considera che si leghi a epitopi distinti, non sovrapposti.

Figura 5: Esempi di design sperimentale per lo studio di epitope binning mediante i tre principali approcci analitici

Devono essere soddisfatti due criteri per assegnare gli mAbs allo stesso bin. Innanzitutto, tutti gli mAbs nello stesso bin dovrebbero bloccare reciprocamente la capacità dell'altro di legare l'antigene. Secondo, tutti i mAbs nello stesso bin dovrebbero avere profili di bloccaggio simili se abbinati ad altri mAbs nel pannello.

Figura 6: Dati rappresentativi di un'analisi binning in-tandem. Le frecce indicano le tre linee di base per questo formato di analisi: prima del caricamento dell'antigene (controllo del sensore), dopo il caricamento dell'antigene prima del legame del mAb saturo (Ab1) e prima del legame del mAb concorrente (Ab2). Le fasi di baseline rimuovono qualsiasi antigene/anticorpo non legato dal biosensore e la linea di base dopo Ab1 può anche essere utilizzata per identificare mAbs con alti off-rates.

Negli stadi di early drug development, vengono utilizzati saggi di competizione incrociata per caratterizzare centinaia di cloni di anticorpi e possono essere eseguiti con surnatanti di ibridoma, lisati di fago o campioni purificati (si veda Parte 2). Poiché i mAbs in diversi contenitori si legano a epitopi distinti e mostrano diverse caratteristiche funzionali, gli studi di epitope binning possono aumentare la probabilità di scegliere l’anticorpo “lead” con l'attività biologica desiderata. Vengono inoltre eseguiti saggi di competizione incrociata per identificare gli mAb che legano epitopi simili a un mAb precedentemente caratterizzato come nella generazione di biosimilari o biobetters. Questi test possono anche essere utili nella selezione di reagenti per analisi di tipo sandwich o ELISA, come quelli usati per i test sui biomarcatori o per i test farmacodinamici, per identificare le coppie di anticorpi che si legano contemporaneamente all'antigene.

 

La seconda parte sarà pubblicata martedì 24/03, non vuoi aspettare? Contattaci!