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01 Ottobre 2019

Studio delle Vescicole Extracellulari mediante la microscopia a super-risoluzione

Gli esosomi così come altri tipi di vescicole extracellulari (EVs) rivestono un ruolo essenziale nella comunicazione tra cellule. Le EVs sono in grado di attraversare barriere biologiche, come la barriera emato-encefalica, ed essere internalizzate nella cellula con elevata specificità. Questo le rende candidati ideali come sistemi innovativi per veicolare farmaci o come fattori diagnostici. Esse, infatti, vengono rilasciate sia da cellule sane che da cellule affette da disordini o infezioni, possono trasportare e poi trasmettere carichi pericolosi, quali virus, tossine, proteine associate a malattie neurodegenerative o molecole di RNA e proteine collegate al cancro quando rilasciate da cellule tumorali (Candelario and Steindler). Per queste ragioni, le vescicole extracellulari possono contribuire in maniera determinante al progredire di una patologia. La visualizzazione in tempo reale dell’interazione tra le vescicole e le cellule target, così come tracciare i loro movimenti all’interno delle cellule, può far luce su molti aspetti del loro coinvolgimento nelle diverse patologie. Questa guida si propone di trattare i progressi più recenti nell’imaging in fluorescenza a super-risoluzione e nella caratterizzazione delle vescicole extracellulari.

Sfide nella visualizzazione delle EVs

Le vescicole extracellulari originano da diverse cellule o tessuti e sono destinate a specifici siti target, dove sono deputate a svolgere funzioni precise. Il loro diametro idrodinamico va dai 30 ai 2000 nm, ma si può distinguere un sottogruppo di grande interesse scientifico, gli esosomi, che comprende quelle di dimensioni comprese tra i 30 e i 120 nm circa. A causa di queste ridotte dimensioni, gli esosomi ricadono in quella categoria di oggetti più piccoli della risoluzione teorica raggiungibile da un microcopio ottico convenzionale, ponendo dei grossi limiti al loro studio. Inoltre, poiché le EVs possono variare anche molto in dimensioni e contenuto, si pensa che la loro selettività sia imputabile alla presenza di biomarcatori specifici per i diversi sottogruppi di EVs (tetraspanine, integrine e altre proteine) (Lyden et al 2015). Tuttavia, la caratterizzazione di questi biomarcatori su singole EVs pone sfide significative ai ricercatori impegnati in questo campo.
Le tecniche di microscopia elettronica permettono di risolvere le singole vescicole, ma non rendono facile l’individuazione di più marcatori simultaneamente e sono limitate a campioni fissati. Mediante le tecniche di microscopia ottica convenzionale, invece, si possono marcare simultaneamente diverse proteine, ma le ridotte dimensioni delle EVs fanno sì che la maggior parte ricada al di sotto del limite della diffrazione della microscopia ottica, rendendo impossibile definirne le dimensioni e quindi limitando l’utilizzo di queste tecniche all’identificazione delle diverse sotto-popolazioni di vescicole.

La super-risoluzione per caratterizzare le EVs

La microscopia a super-risoluzione sorpassa la barriera risolutiva dei microscopi ottici convenzionali e permette l’individuazione e la quantificazione di singole proteine e acidi nucleici a livello sub-vescicolare. Inoltre, mediante la microscopia single-molecule localization (SMLM) la composizione strutturale delle membrane può essere studiata con una risoluzione che raggiunge i 20 nm, permettendo l’identificazione di biomolecole specifiche coinvolte nel signalling e targeting delle EVs.
L’impiego delle tecniche di microscopia a super-risoluzione, come PALM e dSTORM, è di grande utilità nell’individuazione e visualizzazione di sotto-popolazioni di EVs e può fornire informazioni aggiuntive nello studio del ruolo delle EVs nella progressione di molte patologie. Infatti, l’applicazione di due tecniche completamente ortogonali nello stesso strumento rappresenta un approccio robusto alla caratterizzazione delle EVs.

I vantaggi della dSTORM nello studio delle EVs

La tecnica dSTORM permette di acquisire immagini di molecole fluorescenti con una risoluzione che raggiunge i 20 nm. Ciò significa che è possibile visualizzare non solo i marcatori presenti sulle singole vescicole (come proteine o RNA), ma anche la loro distribuzione relativa. Grazie a queste immagini, si può utilizzare la dSTORM per ricavare direttamente la dimensione delle vescicole immobilizzate sul vetrino, nello stesso modo in cui nel passato è stata usata la microscopia elettronica.
La figura 1 fornisce un esempio eccellente dell’applicazione della tecnica dSTORM nello studio delle EVs. La vescicola, isolata dal surnatante di una coltura di cheratinociti umani, è stata marcata con lectine fluorescenti che legano in modo specifico la componente terminale glicolica della membrana della vescicola (magenta). Le EVs sono state successivamente marcate con una combinazione di anticorpi che riconoscono le tetraspanine più conosciute, CD63 (blu) e CD81 (giallo). La dimensione stimata della vescicola nell’esempio è approssimativamente di 156 nm, così come indicato dalla distribuzione di CD63 (picchi blu), dato che la marcatura con lectine aggiunge 20-40 nm per lato.

Fig.1 Applicazione della tecnica dSTORM nello studio delle EVs

La microscopia a super-risoluzione apre ad un ampio spettro di possibilità nello studio dei meccanismi che stanno alla base della biogenesi e del comportamento delle vescicole, sia in soluzione che nelle cellule. Mediante la dSTORM possiamo esplorare in dettaglio come e dove le singole vescicole si assemblano, si accumulano e interagiscono. Si può studiare l’organizzazione delle molecole sulla membrana e all’interno della vescicola, la loro distribuzione spaziale e come questa influisce sulle dimensioni e sul destino delle EVs.

Tracciare i movimenti delle EVs in campioni di cellule live

Quando le EVs raggiungono le loro cellule target si legano alla membrana plasmatica e possono essere internalizzate o rilasciare il loro contenuto all’interno del citoplasma mediante la fusione delle membrane, un processo che è oggetto di molti studi e ad oggi ancora poco chiaro.Quando le EVs raggiungono le loro cellule target si legano alla membrana plasmatica e possono essere internalizzate o rilasciare il loro contenuto all’interno del citoplasma mediante la fusione delle membrane, un processo che è oggetto di molti studi e ad oggi ancora poco chiaro.La microscopia a fluorescenza avanzata, in particolare la tecnica PALM, permette di individuare singole EVs in tempo reale, tracciando sia la loro interazione e incorporazione in cellule vive, sia i loro movimenti post-internalizzazione. Inoltre, grazie alla possibilità di marcare singole specie con l’immunofluorescenza, è possibile discriminare sotto-popolazioni di vescicole e studiare come la composizione superficiale impatta forma e dimensioni, ma anche il destino e il target delle EVs.

Dimensioni e concentrazione con il particle tracking

Oltre ad osservare le dinamiche delle EVs in campioni di cellule vive, la microscopia a fluorescenza a singola molecola PALM può essere utilizzata per seguire le traiettorie di vescicole marcate in soluzione attraverso una tecnica comunemente nota come nanoparticle tracking analysis (NTA), un’analisi basata sul tracciamento dei moti browniani delle singole particelle. L’NTA calcola la velocità di spostamento delle molecole, nota come coefficiente di diffusione, e ne ricava la dimensione delle particelle. Poiché l’NTA analizza singole particelle, può essere utilizzata anche per misurare la concentrazione delle particelle in soluzione. Fornendo informazioni quantitative sulle proprietà delle EVs in soluzione, come dimensione e concentrazione, l’NTA è una tecnica largamente diffusa nella comunità scientifica dedicata allo studio delle EVs.
Con un microscopio a super risoluzione a singola molecola, le dimensioni misurate mediante NTA possono poi essere messe a confronto con quelle ottenute con le immagini dSTORM sulla stessa popolazione di vescicole, come descritto nel paragrafo precedente. Inoltre, grazie alla specificità della marcatura a fluorescenza, è possibile rilevare differenze in dimensioni tra diverse sotto-popolazioni di EVs.

Immagini dSTORM di vescicole extracellulari isolate dal surnatante di una coltura di cheratinociti umani, marcati con anticorpi anti- CD63 e anti-CD81 e con WGA per le membrane. Ogni vescicola è stata evidenziata con un diverso colore. Campioni dall’Imaging Team di ONI

La soluzione con il Nanoimager

Approccio multi-metodo allo studio delle vescicole extracellulari

Il Nanoimager è uno dei microscopi più sensibili sul mercato grazie al suo unico design compatto. E’ particolarmente utile per i ricercatori nel campo delle vescicole extracellulari in quanto dispone di analisi dedicate alle misure di dimensioni e concentrazione, combinando la microscopia a super-risoluzione all’imaging di cellule vive nel formato più accessibile mai concepito. Utilizzando questa piattaforma, le popolazioni di vescicole possono essere caratterizzate mediante metodi ortogonali e successivamente osservate in super-risoluzione per studiarne le interazioni e l’internalizzazione nelle cellule.
Si possono acquisire immagini e video di cellule vive, studiare l’internalizzazione mediante structured illumination microscopy (SIM) ad alta risoluzione, o mediante il tracking, investigare l’interazione delle vescicole con la membrana cellulare in tempo reale.
Il destino delle vescicole una volta internalizzate può essere studiato mediante la tecnica dSTORM: le cellule vengono fissate dopo un’incubazione con le vescicole e le EVs e diverse molecole target (come lisosomi o marker endocitici) possono essere marcate in modo specifico con l’immunofluorescenza.
Il Nanoimager permette l’impiego di un range molto vario di tecniche di imaging, rendendo possibile lo studio delle dinamiche delle vescicole extracellulari e delle loro interazioni mediante una combinazione di diversi approcci. Grazie alla possibilità di riscaldare l’intero corpo dello strumento e al sistema unico di auto-focus, il microscopio si presta molto bene all’imaging in vivo e a seguire i movimenti delle vescicole all’interno delle cellule o in soluzione, mantenendo il fuoco anche durante lunghe acquisizioni.
Seguendo le traiettorie di particelle in soluzione marcate fluorescenti, il Nanoimager è in grado di quantificare il numero e le dimensioni di popolazioni di vescicole extracellulari applicando la nanoparticle tracking analysis (NTA).

CASE STUDY

Visualizzare le dinamiche e le interazioni di vescicole extracellulari in cellule vive

In questo studio sono stati visualizzati i movimenti post-internalizzazione nelle cellule di una popolazione di vescicole extracellulari precedentemente caratterizzate per dimensioni con la tecnica NTA, allo scopo di studiare le interazioni con il nucleo cellulare, come presentato in figura. Il fine ultimo è quello di far luce sul ruolo delle vescicole extracellulari nel cancro.
Le vescicole extracellulari sono state inizialmente isolate da una linea cellulare umana di linfoma di Burkitt, marcate con AlexaFluor647 e purificate mediante size exclusion chromatography (SEC). In questo particolare caso è stato utilizzato un tool automatico di identificazione e dimensionamento delle particelle per quantificare e misurare le dimensioni della popolazione di vescicole in soluzione (pannello A). Il grafico in basso rappresenta la distribuzione dimensionale delle vescicole purificate, con un picco rappresentato da particelle di circa 120 nm di diametro. La figura mostra anche dei tracciati rappresentativi dove la scala cromatica rappresenta i coefficienti di diffusione mentre il segnale in rosso è un’immagine in wide-field di una singola vescicola in un frame, durante un’acquisizione di 1000 frames.
Successivamente, le popolazioni di vescicole purificate sono state incubate con le cellule per diverse ore, allo scopo di farle internalizzare. Mediante la funzione di single-particle tracking, è stato utilizzato il Nanoimager per acquisire e tracciare il movimento post-internalizzazione delle vescicole nella cellula (pannello B). I risultati (un esempio è mostrato nel pannello C) indicano che il moto delle vescicole, misurato come coefficiente di diffusione, è più lento nelle aree attorno al nucleo rispetto alla periferia della cellula. Questo tipo di informazioni difficilmente possono essere ottenute con tecniche diverse dalla microscopia, e soltanto la super-risoluzione ci fornisce la possibilità di indagare questi fenomeni a livello di singola molecola.

Campioni forniti dal laboratorio del Prof. C. Gregory, Università of Edimburgo

Cellule endoteliali umane del cordone ombelicale, il nucleo è marcato con Hoechst (verde) e le EVs con AF647 (magenta). Campioni forniti dalla Sig.ra Maria Panagopoulou e dalla dott.ssa Margaret Paterson del laboratorio del Prof. Christopher Gregory, Università di Edimburgo.

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