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10 Dicembre 2020

Alice Brun

Terapia genica: lisi cellulare con la tecnologia Microfluidizer®

La terapia genica è una modalità di trattamento della malattia a livello genetico. Secondo gli studi teorici, la sostituzione del gene o nucleotide identificato come responsabile della malattia, ne curerà il disturbo. Ad oggi sono numerosi i prodotti per la terapia genica approvati e commercializzati in tutto il mondo, ad esempio per trattare la cecità congenita, l'emofilia, il Parkinson, il mieloma multiplo, etc.

Esistono diverse modalità di terapia genica: può essere sostituito o eliminato il gene mutato, oppure può essere introdotto un nuovo gene per aiutare il corpo a combattere la malattia. Per la somministrazione di materiale genetico i vettori più utilizzati nelle applicazioni cliniche e precliniche sono i vettori virali: gli adenovirus, i virus adenoassociati (AAVs), i retrovirus e i lentivirus. In particolare gli adenovirus e i virus adenoassociati sono preferibili poiché non si integrano nel genoma della cellula ospite.

Quando è necessaria la lisi cellulare?

La produzione di virus coinvolge diversi processi di produzione a monte e di purificazione a valle. Lo sviluppo e l’ottimizzazione di metodi di processo scalabili per la raccolta e la purificazione dei vettori virali è uno step critico e a volte impegnativo. Il metodo tradizionale per la lisi delle cellule nello stesso ambiente di produzione prevede ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. Tuttavia, i potenziali problemi di contaminazione associati a questo metodo lo rendo poco adatto alla produzione su larga scala. Inoltre, è un processo dispendioso sia in termini di tempo che di lavoro.

Caso studio: paragone tra la Tecnica Microfluidizer e il metodo di congelamento-scongelamento

In questo caso studio vengono confrontati i 2 metodi per il recupero di virus: gli adenovirus (AAV) sono coltivati in cellule renali embrionali umane (HEK293) e sospesi in un tampone Tris, prima della lisi condotta con entrambi i metodi.  

Le immagini al microscopio ottico (fig 1) prima e dopo la fase di omogenizzazione con la tecnologia Microfluidizer, evidenzano chiaramente la rottura di quasi tutte le cellule con un unico passaggio a 4.000 psi (275 bars).

Fig 1: Microfluidizer homogenization step immagine al microscopio di cellule prima e dopo il processo di omogenizzazione con tecnologia microfluidizer

Fig 2: Numero di adenovirus recuperati dopo la lisi cellulare con metodo congelamento-scongelamento e tecnologia Microfluidizer

La figura 2 dimostra come il numero di adenovirus AAV raccolti con la tecnologia Microfluidizer sia significativamente (circa il 50%) superiore a quanto ottenuto utilizzando il metodo congelamento-scongelamento. Inoltre quest’ultimo metodo citato impiega oltre 5 ore, mentre il processo con tecnologia Microfluidizer viene completato in meno di un’ora, comprese tutte le fasi di preparazione e purificazione.

 

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