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11 Marzo 2021

Roberto Santoliquido

Vaccini per combattere l’epidemia di Covid-19: l’importanza dei liposomi

Si discute ormai da tempo dei vantaggi e potenzialità della nanomedicina e i primi vaccini autorizzati in Europa per contrastare l’epidemia di COVID-19 sono basati su sistemi liposomiali, dimostrando ancora una volta come i farmaci nanostrutturati possono giocare un ruolo di primissimo piano.

L’AIFA riporta informazioni dettagliate sulla composizione del vaccino Pfizer BioNtech, di cui si è molto sentito parlare recentemente:

“Il COVID-19 mRNA BNT162b2 (Comirnaty) contiene un RNA messaggero che non può propagare se stesso nelle cellule dell’ospite, ma induce la sintesi di antigeni del virus SARS-CoV-2 (che esso stesso codifica). Gli antigeni S del virus stimolano la risposta anticorpale della persona vaccinata con produzione di anticorpi neutralizzanti. L’RNA messaggero è racchiuso in liposomi formati da ALC-0315 ((4-idrossibutil)azanediil)bis(esano6,1-diil)bis(2-esildecanoato) e ALC-0159 (2-[(polietilenglicole)-2000]-N,N-ditetradecilacetammide). ALC-0315 e ALC-0159 sono lipidi sintetici che contribuiscono a formare le vescicole che veicolano il vaccino”[1]

La formulazione di farmaci a base di liposomi necessita l’uso di tecnologie analitiche specifiche in grado di analizzarne la dimensione, morfologia, integrità, l’effettivo carico del principio attivo e la loro stabilità in diversi ambienti.

La caratterizzazione di una formulazione a base di liposomi richiede l’ausilio di tecniche complementari, queste particelle con diametro di circa 100 nm, possono essere osservate ad esempio con microscopi CryoTEM. Le analisi in imaging tuttavia non possono essere utilizzate per un controllo qualitativo e quantitativo quotidiano, essendo particolarmente dispendiose in termini di tempo e costo. Inoltre per essere statisticamente rappresentative necessiterebbero di numerose acquisizioni.

Le tecniche di Light Scattering, attraverso lo strumento Zetasizer della Malvern Panlytical, riescono invece a fornire in modo rapido un’analisi dimensionale del campione (Dynamic Light Scattering) direttamente sulla formulazione stessa . Inoltre, grazie alla tecnologia Electrophoretic Light Scattering e la misura del Potenziale Zeta, è possibile predire la stabilità dei liposomi in diverse formulazioni. Con l’avvento della nuova tecnica MADLS (Multi Angle Dynamic Light Scattering) lo strumento Zetasizer ULTRA è in grado di  aumentare la sua capacità risolutiva e rilevare la concentrazione di particelle in termini di particles/mL. La concentrazione in numero dei liposomi rappresenta un ulteriore parametro per ottimizzare il dosaggio del farmaco, in particolare durante i test in vivo.

La Field Flow Fractionation è una tecnica aggiuntiva a supporto dei produttori di nanofarmaci , recentemente il Laboratorio Europeo di Caratterizzazione dei Nanofarmaci (European Union Nanomedicine Characterization Laboratory) di Ispra e il National Cancer Institute - Nanotechnology Characterization Laboratory di Dublino stanno collaborando con l’istituto normativo American Society for Testing and Materials International (ASTM) sulla caratterizzazione fisica di formulazioni di farmaci liposomiali con tecnica Field-Flow Fractionation ("Physical characterization of liposomal drug formulations using multi-detector asymmetrical-flow field flow fractionation”). La tecnica AF4 della Postnova Analytics rende possibile un’analisi multi parametrica di un campione di liposomi e viene applicata anche per l’analisi di particelle lipidiche solide SLN (solid lipid nanoparticles), vescicole extracellulari (Evs ), particelle polimeriche o metalliche. Le particelle vengono separate per dimensione all’interno del canale ed eluiscono in ordine di dimensione, prima le più piccole poi le più grandi. A valle del sistema, connessi in serie si trovano vari detector che lavorano in flusso, con ad esempio tecniche di Dynamic light scattering (DLS) o Static Light Scattering multi angolo (MALS ) che con grande accuratezza rilevano sia il Raggio Idrodinamico (Rh) che il Raggio di Girazione (Rg) delle nanoparticelle simultaneamente, rendendo possibile l’accesso a parametri morfologici come lo shape factor  ρ=Rg/Rh.

Lo shape factor è indicativo della forma della particelle e la loro morfologia, ma può essere utilizzato anche per l’analisi di proteine differenziando perfettamente una beta amiloide da una proteina globulare.

Figura 1 Fattore di forma e corrispondenza morfologica

In una recente pubblicazione dal titolo “Asymmetric-flow field-flow fractionation for measuring particle size, drug loading and (in)stability of nanopharmaceuticals.” Calzolai et al. dimostrano l’estrema utilità dell’AF4 nell’analisi di un nanofarmaco prendendo come esempio il Doxil®, la prima nanomedicina introdotta sul mercato nel 1995, la quale ha drammaticamente abbassato la cardiotossicità della doxorubicina libera. In questo lavoro è stata testata la tecnica AF4 per la determinazione della quantità di principio attivo libero sia in condizioni standard (media acquoso) che nel plasma. L’interessante esperimento studia l’efficienza di rilascio del principio attivo, utilizzando, delle vescicole multi lamellari più grandi (le MLVs simulano le cellule del sangue), come stimolanti dell’effetto di partizione del principio attivo.

Il frattogramma dei liposomi carichi con il principio attivo è riportato nella figura 2 Il recupero (recovery) totale del principio attivo per tutti e tre i picchi è stato misurato offline con uno strumentoHPLC ed ha raggiunto un totale pari all’88%. Di questo il 92% è contenuto nel picco principale ( 35-55 minuti) di liposomi con dimensione compresa tra i 75 nm e i 128 nm. Il secondo picco (71-88 minuti) corrisponde al tempo in cui il cross-flow è stato azzerato e quindi alle particelle che sono state forzatamente (artificialmente) aggregate. Solo il 7,4% del principio attivo è presente in questa frazione. Una piccolissima quantità, pari allo 0,6% è stata rilasciata nello step finale.  

Il frattogramma per le MLVs sole è riportato in figura 2B. eluiscono molto più tardi, ovvero quando il cross-flow è ridotto a zero, le MLV comprese tra 163-390 nm non contengono principio attivo (come aspettato).

Figura 2: Frattogrammi delle diverse eluizioni FFF, in rosso il segnale di scattering dello Zetasizer e in verde il valore di z-average rilevato.

Riassumendo, è possibile attraverso la tecnica AF4 predire il comportamento di una nanomedicina, sia in presenza della molecolatarget che in presenza di potenziali fenomeni avversi (contatto con proteine del plasma), con un costo e dei tempi decisamente ridotti rispetto ai test in vivo. La tecnica AF4 si conferma essere estremamente versatile e sicuramente ricoprirà un ruolo fondamentale nello studio dei nanofarmaci del futuro.

Scopri come possiamo supportarti nell’uso di queste tecnologie, contattaci! Scrivete a roberto.santoliquido@alfatest.it per maggiori informazioni.