Misura la dimensione delle Vescicole Extracellulari

Gli strumenti ExoView™ sfruttano le immagini ottenute dalla riflettanza interferometrica di particelle singole (SP-IRIS) e misurano le dimensioni delle singole EV con elevata precisione, analizzando il segnale interferometrico delle EV legate ad un substrato. Questa metodologia consente di visualizzare e caratterizzare EV di piccole dimensioni, fino a 50 nm. L’intensità del segnale interferometrico è correlabile al raggio delle particelle elevato al cubo, conferendo alla misura un’elevata capacità di risoluzione rispetto alle tecniche esistenti. I campioni contenenti EV presentano spesso un’elevata polidispersità e numerose sottopopolazioni, pertanto la risoluzione della misura è un requisito importante: la serie ExoView™ ha una risoluzione picco-picco significativamente elevata e consente di rilevare e separare in modo più accurato sottopopolazioni di vescicole distinte all'interno di un campione eterogeneo. L’alta risoluzione degli strumenti ExoView™ è stata dimostrata separando cinque popolazioni di particelle sferiche di polistirene certificate NIST di dimensioni diverse (40nm, 70nm, 100nm, 150nm e 200nm) in una singola analisi. Pur sapendo che le particelle di polistirene non sono equiparabili alle EV, l'esperimento dimostra le capacità di risoluzione intrinseca della tecnica.

Figura 1: Distribuzione specifica di una miscela di particelle di standard NIST (50nm, 100nm, 150nm e 200nm). La linea blu continua indica i risultati ExoView™ per una miscela di 4 popolazioni di particelle

Concentrazione delle EV

La sierie ExoView™ consente di misurare il numero di EV legate ad un chip, correlandolo ad una concentrazione di EV positivi all'antigene in soluzione. Vengono eseguiti test di controllo per garantire che gli eventi di legame misurati siano specifici e non correlati a legami aspecifici o agli aggregati associati all'anticorpo utilizzato per funzionalizzare la superficie del chip. L'array viene analizzato prima dell'incubazione del campione e qualsiasi evento contaminante può essere escluso dall'analisi. Allo stesso modo, gli eventi di legame non specifici osservati sul controllo negativo possono essere sottratti dai risultati sperimentali.
Il grafico seguente mostra la risposta di linearità degli strumenti ExoView™. Il campione è stato diluito linearmente e il numero di EV positivi per CD81 è stato conteggiato per ogni diluizione. Una misura comparativa, effettuata con uno strumento basato su tecnica NTA (Nanoparticle Tracking Analysis), conferma la linearità dei dati ottenuti (non mostrato).

Fluorescenza a 3 o 4 colori

Misura la fluorescenza a 3 o 4 colori su singole EV’s legate al chip per microarray ExoView™.
Le vescicole extracellulari in soluzione vengono “catturate” senza purificazione e legate a uno dei 6 diversi anticorpi di cattura (più controllo) sulla superficie del chip ExoView™. È possibile aggiungere anticorpi fluorescenti secondari e misurare fino a 3 colori contemporaneamente. Gli anticorpi secondari sono uguali a tutti e 6 gli anticorpi di cattura.
L'elevata sensibilità degli strumenti ExoView ™ può rilevare fino al singolo evento di legame, questo significa che anche le proteine scarsamente espresse sulla più piccola delle vescicole extracellulari saranno rilevabili.

Colocalizzazione dei biomarcatori

Questa immagine mostra le vescicole legate a un singolo punto anti-CD41a sul chip ExoView ™. Tutte le vescicole fotografate in questo punto sono quindi positive per CD41a.
Una volta legate, le vescicole sono state colorate con un “cocktail” fluorescente a 3 o 4 colori di anticorpi contro CD63 / CD81 / CD9.
Le macchie blu sono vescicole positive per CD41a + CD63.
Le macchie verdi sono vescicole positive per CD41a + CD81.
Le macchie rosse sono vescicole positive per CD41a + CD9.

Con la versione R200+ è possibile visualizzare in viola, un quarto anticorpo fluorescente.
Altri colori sono vescicole che esprimono varie combinazioni di segnale fluorescente R / G / B e CD41a (tramite acquisizione in superficie).
Tutte le vescicole vengono simultaneamente dimensionate e contate.
La colocalizzazione dei biomarcatori (4 marker per EV) consente di identificare e misurare sotto-popolazioni uniche di vescicole extracellulari.

Rilevamento del carico EV attraverso la fluorescenza 

Una volta legati al chip ExoView ™, le vescicole extracellulari possono essere permeate e possono essere sondate le proteine luminali e/o il loro contenuto. La fluorescenza a 3 o 4 colori consente una combinazione di colorazione di 3 o 4 proteine superficiali e / o proteine luminali su singole vescicole extracellulari.
Questi esperimenti mostrano la capacità di rilevare proteine luminali come ALIX e Sytenin attraverso la permeabilizzazione delle vescicole extracellulari legate.

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